說壹說(shuo)T100基(ji)因擴增(zeng)儀(yi)由哪(na)三(san)個(ge)基(ji)本反應(ying)步(bu)驟構(gou)成

 

　　本質(zhi)是體(ti)外核(he)酸擴(kuo)增，加(jia)熱(re)使雙(shuang)鏈DNA解開(kai)螺旋(xuan)，在(zai)退(tui)火(huo)溫(wen)度條(tiao)件下引物(wu)同模板(ban)DNA雜(za)交(jiao)，在(zai)TaqDNA聚(ju)合酶(mei)，dNTPs，Mg2+和合適(shi)pH緩沖液存(cun)在(zai)條(tiao)件下延(yan)伸引(yin)物(wu)，重復“變(bian)性(xing)→退(tui)火(huo)→引物(wu)延(yan)伸”過(guo)程(cheng)至25～40個(ge)循(xun)環，呈指(zhi)數級(ji)擴(kuo)大(da)待(dai)測樣本中的核(he)酸拷貝(bei)數。

 

　　擴(kuo)增(zeng)時加(jia)入(ru)的引(yin)物(wu)利(li)用(yong)熒光素(su)進行(xing)標記(ji)，使引(yin)物(wu)和熒光探針(zhen)同時與模(mo)板(ban)進行(xing)特(te)異性(xing)結(jie)合，擴(kuo)增結(jie)果(guo)通(tong)過熒光信號(hao)采集系(xi)統(tong)實(shi)時(shi)采集信(xin)號(hao)並(bing)輸(shu)送到計算(suan)機(ji)分(fen)析(xi)處理系統(tong)，實時(shi)輸(shu)出(chu)量(liang)化結(jie)果(guo)，這(zhe)樣(yang)的PCR儀(yi)叫實時(shi)熒光定量(liang)PCR儀。

 

　　T100基(ji)因擴增(zeng)儀(yi)的操作非常(chang)簡便，接(jie)通(tong)電源(yuan)，儀器(qi)自檢，設(she)置(zhi)溫(wen)度程(cheng)序(xu)或調(tiao)出(chu)儲(chu)存(cun)的程(cheng)序(xu)運行(xing)即可(ke)。

 

　　T100基(ji)因擴增(zeng)儀(yi)技術的原理類似於(yu)DNA的天(tian)然(ran)復制(zhi)過(guo)程(cheng)，其特(te)異性(xing)依(yi)賴於(yu)靶序(xu)列兩(liang)端(duan)互補(bu)的寡核(he)苷(gan)酸引(yin)物(wu)，由變(bian)性(xing)-退(tui)火(huo)-延(yan)伸三(san)個(ge)基(ji)本反應(ying)步(bu)驟構(gou)成。

 

　　1、模板DNA的變(bian)性(xing)：模(mo)板(ban)DNA經加(jia)熱(re)至(zhi)93℃左右壹定(ding)時(shi)間(jian)後(hou)，使模(mo)板DNA雙鏈或(huo)經PCR擴(kuo)增(zeng)形成的雙(shuang)鏈DNA解離(li)，使之(zhi)成(cheng)為(wei)單(dan)鏈(lian)，以便它(ta)與引(yin)物(wu)結(jie)合，為(wei)下(xia)輪(lun)反(fan)應(ying)作(zuo)準備。

 

　　2、模板(ban)DNA與引(yin)物(wu)的退(tui)火：模板(ban)DNA經加(jia)熱(re)變(bian)性(xing)成(cheng)單(dan)鏈後(hou)，溫(wen)度降(jiang)至(zhi)55℃左右，引物(wu)與模(mo)板(ban)DNA單鏈互(hu)補序(xu)列配(pei)對(dui)結(jie)合。

 

　　3、引(yin)物(wu)的延(yan)伸：DNA模(mo)板(ban)-引物(wu)結(jie)合物(wu)在TaqDNA聚(ju)合酶(mei)的作(zuo)用下，以dNTP為(wei)反(fan)應(ying)原料，靶序(xu)列為(wei)模(mo)板(ban)，按堿基(ji)配對與半(ban)保留(liu)復制(zhi)原理，合成(cheng)壹條(tiao)新(xin)的與模(mo)板(ban)DNA鏈互補(bu)的半(ban)保留(liu)復制(zhi)鏈(lian)。

 

　　重復循(xun)環(huan)變(bian)性(xing)-退(tui)火(huo)-延(yan)伸三(san)過程(cheng)，就(jiu)可(ke)獲(huo)得更(geng)多(duo)的“半(ban)保留(liu)復制(zhi)鏈(lian)”，而且這(zhe)種(zhong)新鏈(lian)又可(ke)成為(wei)下(xia)次循(xun)環(huan)的模(mo)板。每完成壹輪(lun)循(xun)環需2~4分(fen)鐘(zhong)，如(ru)此反復進(jin)行(xing)，每壹輪(lun)循(xun)環所產(chan)生的DNA均能成為(wei)下(xia)壹輪(lun)循(xun)環的模(mo)板，每壹輪(lun)循(xun)環都使兩(liang)條(tiao)人(ren)工合成(cheng)的引(yin)物(wu)間(jian)的DNA特(te)異區拷貝(bei)數擴(kuo)增(zeng)1倍，PCR產(chan)物(wu)以2的指(zhi)數形式迅速擴(kuo)增，經過(guo)25~30輪(lun)循(xun)環後(hou)（2~3小(xiao)時(shi)），理論上(shang)可(ke)使基(ji)因擴增(zeng)109倍(bei)以上(shang)，實(shi)際上(shang)壹般(ban)可(ke)達106~107倍。