進口PCR儀常見問題(ti)和(he)解(jie)決(jue)方(fang)案(an)

　　
　　
　　進口PCR儀已經(jing)成(cheng)為(wei)分子生物學(xue)、醫(yi)學(xue)、食品(pin)工業、司法(fa)科(ke)學(xue)、生物技術(shu)、環(huan)境科(ke)學(xue)、微生物學(xue)、臨(lin)床診斷、流行病(bing)學(xue)、遺(yi)傳(chuan)學(xue)、基(ji)因(yin)芯(xin)片、基(ji)因(yin)檢(jian)測(ce)、基(ji)因(yin)克(ke)隆、基(ji)因(yin)表(biao)達(da)等領(ling)域廣(guang)泛(fan)應(ying)用(yong)的(de)壹(yi)種儀器。進口PCR儀在操作中常會(hui)遇(yu)到哪(na)些問題(ti)呢？該(gai)如(ru)何解(jie)決(jue)呢(ne)？
　　
　　1、PCR在產(chan)物序(xu)列(lie)中引(yin)入(ru)了錯(cuo)誤，這大多(duo)是由於聚(ju)合(he)酶忠實(shi)性(xing)低(di)或(huo)者(zhe)循環數太多，這時需(xu)要使用(yong)帶(dai)有校(xiao)正活性(xing)的(de)熱(re)穩(wen)定聚(ju)合(he)酶，同(tong)時(shi)降低(di)循環(huan)數。此外，四種dNTP的(de)濃(nong)度(du)不同(tong)也(ye)會(hui)出(chu)現(xian)該(gai)問(wen)題(ti)，此時應制備新(xin)的(de)濃度(du)相同(tong)的(de)dNTP混合(he)物。
　　
　　2、PCR跑(pao)膠(jiao)，目(mu)的條(tiao)帶(dai)很(hen)亮，但是邊沿不清楚(chu)，前後有拖尾現(xian)象。出現(xian)這樣的問題(ti)，則需(xu)要進行細(xi)致(zhi)的(de)分析(xi)，因(yin)為(wei)引(yin)起(qi)該(gai)問(wen)題(ti)的可(ke)能很(hen)多。可(ke)先檢(jian)查是否模板質量(liang)問(wen)題(ti)，如有(you)降解(jie)等，模板應避免(mian)反復(fu)凍融(rong)。也(ye)有(you)可(ke)能是抽提RNA時(shi)有(you)汙染，則需要重(zhong)新(xin)抽提RNA。此外，也(ye)可(ke)能是非特(te)異(yi)性(xing)擴增(zeng)引(yin)發(fa)該(gai)問(wen)題(ti)，可(ke)提高(gao)退(tui)火溫(wen)度(du)，少循環(huan)次(ci)數(shu)。電(dian)泳(yong)緩沖液時(shi)間太長，ph值(zhi)和(he)鹽離(li)子(zi)濃(nong)度明顯(xian)改(gai)變、電(dian)泳(yong)時電(dian)壓太高(gao)、電(dian)泳(yong)液過久沒(mei)換(huan)，電(dian)泳(yong)膠(jiao)臟(zang)了等都可(ke)能引(yin)發(fa)該(gai)問(wen)題(ti)。如果(guo)不是由上述原(yuan)因(yin)引(yin)起(qi)，則(ze)進壹(yi)步檢(jian)查加樣量(liang)是否過大，制(zhi)膠(jiao)過程中膠(jiao)孔是否制(zhi)好(hao)，EB是否沖洗(xi)幹(gan)凈(jing)、模板中是否混(hun)有(you)基(ji)因(yin)組(zu)DNA或(huo)蛋(dan)白等。也(ye)需(xu)考慮是否擴增(zeng)的(de)條(tiao)件不合(he)適(shi)。針對具體原(yuan)因(yin)再(zai)采(cai)取相應的措(cuo)施。
　　
　　3、PCR產(chan)物何(he)時(shi)需要用(yong)凝(ning)膠(jiao)純化(hua)，何(he)時不需(xu)要？當凝膠(jiao)分析(xi)擴增(zeng)產(chan)物只有(you)壹(yi)條(tiao)帶(dai)時(shi)，則(ze)不(bu)需要使用(yong)凝(ning)膠(jiao)純化(hua)。當(dang)可(ke)見其(qi)他雜(za)帶時(shi)，則可(ke)能是積累了大量(liang)引(yin)物的(de)二(er)聚(ju)體，在克隆前需(xu)要做(zuo)凝膠(jiao)純化(hua)。
　　
　　4、如(ru)果實驗(yan)中沒(mei)有(you)回(hui)收到目(mu)的片段(duan)，則(ze)需要(yao)繼續(xu)進行對(dui)照(zhao)實驗(yan)。包括塗布(bu)未(wei)轉化(hua)的(de)感受態(tai)細(xi)胞(bao)、轉化(hua)完整(zheng)質(zhi)粒，計算(suan)菌(jun)落生長數(shu)，測定轉化(hua)效(xiao)率(lv)、用(yong)pGEM-T或(huo)pGEM-TEasy載(zai)體，連接(jie)pGEM-T正(zheng)對照，轉化(hua)高(gao)頻(pin)率(lv)感(gan)受(shou)態(tai)細(xi)胞(bao)，按照的(de)實驗(yan)步驟(zhou)進行。
　　
　　5、實(shi)驗(yan)中出現(xian)假陽性(xing)擴增(zeng)該(gai)怎(zen)麽(me)辦？這是擴增(zeng)系(xi)統受到汙染的表(biao)現(xian)，應通(tong)過檢查(zha)排(pai)除汙染源。首先考慮是否為(wei)試劑(ji)汙(wu)染，可(ke)將試劑(ji)分裝好直接(jie)置(zhi)於進口PCR儀中擴增(zeng)進行判(pan)斷(duan)。其(qi)次(ci)要(yao)考慮是否為(wei)實(shi)驗(yan)室汙(wu)染，可(ke)更(geng)換所用(yong)的(de)移液(ye)器、吸咀管（離心管）等，將試驗(yan)中的關鍵(jian)步(bu)驟(zhou)轉移到壹(yi)個新(xin)的(de)環境中，判(pan)斷(duan)是否為(wei)實(shi)驗(yan)室汙(wu)染。如果是則需(xu)要(yao)對整(zheng)個實(shi)驗(yan)室及(ji)實驗(yan)器材(cai)*清洗(xi)處理，保(bao)持(chi)良好(hao)的通(tong)風、清潔等。此外，還要考慮是否為(wei)采(cai)樣(yang)汙染，壹(yi)般表(biao)現(xian)為壹(yi)批結果陽性(xing)率(lv)很(hen)高(gao)，壹(yi)批結果陽性(xing)率(lv)又(you)下(xia)降很(hen)多，如(ru)此反復(fu)。解(jie)決(jue)方(fang)法(fa)為(wei)盡(jin)量(liang)使用(yong)壹(yi)次(ci)試管及(ji)吸咀(ju)取樣。
　　
　　6、實驗(yan)中出現(xian)假陰性(xing)擴增(zeng)該(gai)怎(zen)麽(me)辦？首先要考慮是否為(wei)儀器故障，儀器應正常(chang)運(yun)轉，尤(you)其(qi)要註(zhu)意加(jia)熱(re)溫(wen)度(du)及(ji)各管間的(de)差異(yi)是否符(fu)合(he)實驗(yan)要求，是否出(chu)現(xian)誤差等。其(qi)次(ci)要(yao)考慮是否為(wei)試劑(ji)失(shi)效(xiao)或(huo)無(wu)效(xiao)引(yin)起(qi)，使用(yong)有(you)效(xiao)的試劑(ji)。