操作(zuo)ABI PCR儀(yi)時(shi)需要註(zhu)意(yi)的(de)事(shi)項有(you)哪(na)些(xie)？

　　
　　
　　1.PCR引物(wu)設計(ji)：
　　
　　引物(wu)設計(ji)可(ke)能(neng)是(shi)PCR擴(kuo)增(zeng)成(cheng)功zui關鍵的因素(su)。如(ru)引物(wu)設計(ji)欠(qian)佳(jia)，可能(neng)導致擴(kuo)增(zeng)產物(wu)不足(zu)，甚(shen)至擴(kuo)增(zeng)失敗，其(qi)原因是(shi)設(she)計(ji)欠(qian)佳(jia)的引物(wu)可導致非特(te)異擴(kuo)增(zeng)和/或形成(cheng)引物(wu)二聚(ju)體，此(ci)又(you)成(cheng)為PCR反(fan)應(ying)的競爭(zheng)性(xing)產(chan)物(wu)，從而(er)進(jin)壹步(bu)抑(yi)制(zhi)PCR產(chan)物(wu)形成(cheng)。
　　
　　在引物(wu)設計(ji)時(shi)必(bi)須(xu)考(kao)慮以(yi)下幾(ji)個因(yin)素(su)，其(qi)中zui重(zhong)要的(de)是(shi)引物(wu)長度、溶解(jie)溫(wen)度(Tm)、特(te)異性、引物(wu)序(xu)列(lie)互(hu)補問(wen)題(ti)、G/C含(han)量(liang)和多(duo)嘧啶(ding)(T,C)或多(duo)嘌呤(ling)(A,G)延伸(shen)、3’-末端序(xu)列(lie)等。
　　
　　(1)引物(wu)長度：由(you)於(yu)PCR反應(ying)的特異性、退(tui)火(huo)溫(wen)度以(yi)及(ji)時(shi)間均(jun)至少(shao)部(bu)分(fen)與PCR引物(wu)長度相關(guan)聯(lian)，因此(ci)引物(wu)長度是(shi)PCR擴(kuo)增(zeng)是(shi)否(fou)成(cheng)功關鍵的因素(su)。壹(yi)般(ban)PCR引物(wu)長度為(wei)15-30核(he)苷(gan)酸(suan)。
　　
　　(2)溶解(jie)溫(wen)度(Tm)：因(yin)加熱而斷(duan)開(kai)H鍵(jian)，使雙鏈DNA分(fen)開或(huo)“溶解(jie)”為(wei)單(dan)鏈(lian)DNA。溶解(jie)溫(wen)度(Tm)即指使壹半雙鏈(lian)DNA變(bian)為(wei)單(dan)鏈(lian)DNA的(de)溫(wen)度。Tm可(ke)采(cai)用(yong)下列公(gong)式計(ji)算：Tm＝2(A+T)+4(G+C)。
　　
　　需註(zhu)意(yi)PCR反應(ying)至少(shao)有(you)兩個(ge)(壹對)引物(wu)，兩個(ge)寡核(he)苷(gan)酸(suan)引物(wu)Tm值應(ying)比較接近，不可(ke)差(cha)異過大(da)。因(yin)有(you)較高(gao)的Tm值的引物(wu)在較(jiao)低的(de)反應(ying)溫(wen)度時(shi)可(ke)發(fa)生錯(cuo)配(pei)，而(er)引物(wu)Tm值較(jiao)低，反(fan)應(ying)溫(wen)度較(jiao)高時(shi)則(ze)可能(neng)不能(neng)發(fa)生作(zuo)用(yong)，因(yin)此(ci)如(ru)引物(wu)的Tm值(zhi)差(cha)異較大(da)，可(ke)導致PCR擴(kuo)增(zeng)效(xiao)率(lv)低下(xia)甚(shen)至擴(kuo)增(zeng)失敗。
　　
　　(3)引物(wu)序(xu)列(lie)互(hu)補：設計(ji)引物(wu)時(shi)應(ying)沒(mei)有(you)3個堿(jian)基(ji)以上(shang)的內引物(wu)配對(dui)，如引物(wu)有(you)這(zhe)樣具(ju)有(you)自我(wo)配對(dui)的區(qu)域，“彈(dan)回(hui)”即部(bu)分(fen)雙鏈(lian)結構將(jiang)發(fa)生在(zai)退(tui)火(huo)反(fan)應(ying)時(shi)。
　　
　　(4)G/C含(han)量(liang)和多(duo)嘧啶(ding)(T,C)或多(duo)嘌呤(ling)(A,G)延伸(shen)：待(dai)選擇的(de)引物(wu)序(xu)列(lie)應(ying)盡(jin)可(ke)能(neng)是(shi)堿(jian)基(ji)隨(sui)意(yi)分(fen)布(bu)，G+C含(han)量(liang)平均(jun)-避免長(chang)A+T和富含(han)G+C的(de)區(qu)域。在(zai)引物(wu)的堿(jian)基(ji)組成(cheng)中GC含(han)量(liang)壹般(ban)為45％-55％。在(zai)選擇的(de)引物(wu)序(xu)列(lie)中應(ying)沒(mei)有(you)多(duo)G或多(duo)C延伸(shen)，因(yin)其(qi)可促進(jin)非特(te)異性退(tui)火(huo)，多(duo)A和多(duo)T延伸(shen)也(ye)應(ying)避免，因(yin)其(qi)可“呼吸”和使引物(wu)－模板(ban)復(fu)合物(wu)展開(kai)延伸(shen)，降(jiang)低擴(kuo)增(zeng)的效(xiao)率(lv)。同時(shi)多(duo)嘧啶(ding)(T,C)和多(duo)嘌呤(ling)(A,G)延伸(shen)也(ye)應(ying)被(bei)避(bi)免。
　　
　　(5)3’-末端序(xu)列(lie)：為控(kong)制引物(wu)錯(cuo)配(pei)，應(ying)認真地確定PCR引物(wu)中3’末端的(de)位置。
　　
　　總(zong)而言之，應(ying)重(zhong)視PCR引物(wu)設計(ji)，設(she)計(ji)PCR引物(wu)時(shi)應(ying)認真小心(xin)。對於(yu)壹(yi)個(ge)成(cheng)功的PCR來(lai)說(shuo)，幾(ji)個重(zhong)要因(yin)素(su)如(ru)引物(wu)長度、GC含(han)量(liang)和3’序(xu)列(lie)必須優化(hua)。理想的(de)引物(wu)應(ying)為差(cha)不(bu)多(duo)隨(sui)意(yi)分(fen)布(bu)的(de)核(he)苷(gan)酸(suan)混(hun)合、GC含(han)量(liang)50％、長度約(yue)為20個(ge)堿基(ji)，因此(ci)能(neng)使Tm值處(chu)於56-62ºC範圍。分(fen)析(xi)靶(ba)基(ji)因潛(qian)在(zai)引物(wu)位點(dian)時(shi)，應(ying)考(kao)慮無單(dan)聚(ju)合體,沒(mei)有(you)明(ming)顯的二級結構形成(cheng)的傾(qing)向，不(bu)自我(wo)互(hu)補，與其(qi)他雙鏈(lian)靶(ba)基(ji)因序(xu)列(lie)沒(mei)有(you)明(ming)顯的同源(yuan)性(xing)。為(wei)避免枯燥(zao)無味(wei)的設計(ji)，節(jie)省(sheng)時(shi)間，減(jian)少(shao)錯(cuo)誤(wu)，可(ke)應(ying)用計(ji)算機程序(xu)優(you)化設計(ji)、選擇、確(que)定寡核(he)苷(gan)酸(suan)引物(wu)。